Los miembros del género Salmonella son importantes agentes etiológicos de gastroenteritis e infecciones tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo.1, 2, 3 En los últimos años, Salmonella infantis fue la segunda serovariedad más frecuente en Argentina luego de Salmonella enteritidis, con 85% de los aislamientos provenientes de pacientes pediátricos hospitalizados y frecuentemente asociados a brotes hospitalarios.4

Aunque el tratamiento antimicrobiano no es necesario en la mayoría de los casos de salmonelosis, los antibióticos son utilizados en infecciones extraintestinales y en pacientes inmunocomprometidos5 y son las cefalosporinas de amplio espectro las usadas comúnmente para el tratamiento de la salmonelosis extraintestinal, aunque desde 1984 han sido reportados aislamientos de salmonellas resistentes en diferentes países.6, 7, 8, 9

La resistencia a â-lactámicos debido a â-lactamasas de espectro extendido (BLEE) entre las serovariedades de Salmonella es un hecho cada vez más frecuente en todo el mundo, con diferencias claras en la prevalencia dentro y entre regiones geográ.cas particulares.10

Las cepas productoras de BLEE deben ser consideradas clínicamente resistentes a penicilinas, cefalosporinas y aztreonam, independientemente de su aparente susceptibilidad in vitro a algunos de esos agentes, aunque pueden permanecer sensibles a las cefamicinas (cefoxitina) y carbapenemes (imipenem y meropenem),11 por lo que el per.l de multirresistencia presentado usualmente por las cepas de salmonellas productoras de BLEE trae aparejados problemas terapéuticos de grandes dimensiones, principalmente en el ámbito hospitalario.12

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la resistencia a antibióticos â-lactámicos y los mecanismos de resistencia involucrados en cepas de Salmonella infantis aislados a partir de pacientes pediátricos hospitalizados en el nordeste de Argentina, a .n de compararlos con hallazgos similares en otras regiones de ese país.

Entre febrero y diciembre de 1998 fueron recuperados 29 aislamientos de Salmonella infantis a partir de heces de pacientes pediátricos hospitalizados en el nordeste de Argentina. Los aislamientos fueron identi.cados bioquímicamente mediante métodos convencionales13 y serotipificados en el Laboratorio Nacional de Referencia INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, de Buenos Aires, Argentina. Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana fueron realizadas mediante el método de difusión con discos según las recomendaciones del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14

Los antimicrobianos probados fueron: ampicilina 10 µã (AMP), ampicilina/ácido clavulánico 10/10 µã (AMC), cefalotina (CEP), gentamicina 10 µã (GEN), neomicina 30 µã (NEO), cefotaxima 30 µã (CTX), ceftazidima 30 µã (CAZ), cefoxitina 30 µã (FOX), tetraciclina 30 mg (TET), cloranfenicol 30 mg (CMP), colistina 10 µã (COL), furazolidona 100 µã (FUR), ácido nalidixico 30 µã (NAL), cipro.oxacina 5 µã (CIP), trimetoprim/sulfametoxazol 1.25/23.75 µã (TMS), y fosfomicina 200 µã (FOS). Cuando los diámetros de la zona de inhibición fueron £ 27 mm para CTX y/o £ 22 mm para CAZ, se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs) para AMP, AMC, FOX, CTX y CAZ mediante el método de dilución en agar siguiendo los lineamientos del NCCLS.14 Adicionalmente, en estas últimas cepas se aplicó el método con.rmatorio para BLEE utilizando simultáneamente discos de CTX y cefotaxima-ácido clavulánico 30/10 µã (CTX/CLA).14 Como control de calidad interno se utilizaron las cepas de E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC 27853.

Los ensayos de conjugación se llevaron a cabo en medio sólido utilizando como receptora a E. coli DH5a, según descripciones previas.8

La producción de â-lactamasas fue estudiada en 5 cepas susceptibles a CTX y en 10 cepas resistentes a CTX mediante dos métodos diferentes: a) Isoelectroenfoque (IEF) y b) Ampli.cación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genes codi.cantes de â-lactamasas. Para el IEF fue aplicado el método descripto por Gallardo y cols.12 utilizando aislamientos portadores de â-lactamasas conocidas.

Para detectar los genes codi.cadores de â-lactamasas se utilizaron en la ampli.cación los pares de cebadores bla-TEM, blaSHV, blaCARB, blaOXA-1, blaOXA-2, blaOXA-10, blaAMPC, blaPER, y blaCTX-M-2.16, 17, 18 Los parámetros de ampli.cación aplicados fueron aquellos previamente descriptos.17, 19, 20 Como controles se utilizaron varias cepas conteniendo genes conocidos de â-lactamasas. La presencia del integrón de Clase I fue determinada por PCR utilizando el cebador intiI bajo condiciones de amplificación descriptas por Arduino et al.21

Entre las 29 cepas estudiadas, todas ellas fueron resistentes a AMP y CEP pero susceptibles a FOX, CIP, NAL, FOS, COL, NEO, TET y CMP. Diez cepas mostraron diámetros £ 27 mm para CTX y fueron además resistentes a GEN y FUR; sólo una de ellas fue resistente a TMS.

Todas las cepas resistentes a CTX mostraron un aumento ¡Ý5 mm en el diámetro del halo de inhibición para CTX/CLA con respecto a los de CTX.

Los valores de CIMs de los antibióticos â-lactámicos para las cepas resistentes a CTX se muestran en el Cuadro 1. Los valores de CIMs para CTX determinadas por el método de dilución en agar fueron coincidentes con aquellos encontrados mediante el E-test. Mediante IEF se detectó una â-lactamasa con un aparente pI de 5,4 en los 15 aislamientos y en las 10 cepas resistentes a CTX se detectó una b-lactamasa adicional con pI = 8.7.

Cuando se sometieron a PCR, las 15 cepas resultaron negativas para blaOXA, blaSHV, blaCARB, blaAMPC y bla-PER, pero en todas las cepas se obtuvo un fragmento de 850 bp con blaTEM y sólo en aquellas resistentes a CTX se apreció una banda de 900 bp cuando se usaron los iniciadores blaCTX-M-2.

Las cepas transconjugantes de Escherichia coli resultaron ser resistentes a CTX con CIMs entre 16 y 128 mg/ml y mediante PCR con los iniciadores intiI se obtuvieron bandas de aproximadamente 2000 bp tanto en las bacterias donantes como en las transconjugantes.

La presencia de una â-lactamasa tipo TEM-1 en la totalidad de las cepas estudiadas y la presencia de una â-lactamasa adicional tipo CTX-M-2 en las cepas resistentes a CTX es sugerida, por tanto, los resultados obtenidos mediante IEF como aquéllos obtenidos mediante ampli.cación con mediante PCR, a la vez que son consistentes con los perfiles de susceptibilidad mostrados a través de las pruebas de difusión con discos22, 23.

Entre las â-lactamasas de espectro ampliado (BLEA), las del tipo TEM-1 son las que con mayor frecuencia se asocian con la resistencia a AMP y CEP,22 mientras que CTX-M-2, otra â-lactamasa codi.cada en plásmidos, es una â-lactamasa de espectro extendido (BLEE) con actividad de cefotaximasa. Esta enzima posee pobre actividad frente a FOX y es mucho más activa frente a CTX que frente a CAZ o aztreonam.12 Ambas enzimas son inhibibles por inhibidores de â-lactamasas como sulbactama, tazobactama y ácido clavulánico.

Las â-lactamasas del tipo CTX-M están ampliamente diseminadas en todo el mundo, con diferentes prevalencias de sus subtipos de acuerdo a regiones geográ.cas.10 La familia CTX-M comprende varios miembros, con un grado variable de identidad aminoacídica; CTX-M-2 es la más cercanamente relacionada con Toho-1 y dos â-lactamasas cromosómicas de Kluyvera ascorbata.11 En Argentina, CTX-M-2 es la â-lactamasa más frecuente y el 15% de 155 aislamientos nosocomiales de Salmonella estudiados entre 1984 y 1998 en dicho país poseían genes del tipo blaTEM y blaCTX-M-2, ambos relacionados con plásmidos R transferibles;24 entre esos aislamientos, solamente 4 fueron Salmonella infantis.

En el presente trabajo, tanto los ensayos de conjugación como la ampli.cación con intiI con.rmaron que la resistencia a CTX estaba localizada en un plásmido conjugativo conteniendo un integrón de Clase I.

Entre abril de 1997 y agosto de 1998, fue detectado en Santa Fe, Argentina, un brote hospitalario debido a Salmonella infantis productoras de BLEE y seis aislamientos representativos de aquellos involucrados en el brote fueron estudiadas por Di Conza et al.23 Las cepas fueron resistentes a CEP, CTX, CAZ, GEN y FUR y presentaron genes codificantes de â-lactamasas del tipo TEM-1 y CTX-M-2, cuya entidad fue con.rmada por secuenciación del ADN. Estos autores hallaron un nuevo integrón de Clase I (InS21) portador de los genes blaCTX-M-2 los cuales pudieron ser transferidos a una cepa receptora en asociación con la resistencia a aminoglucósidos, sulfonamida y nitrofurantoína. Adicionalmente, Arduino y cols. encontraron que blaCTX-M-2 está localizado en un integrón inusual de Clase I (In35) cuando analizaron varios aislamientos hospitalarios, incluyendo 10 cepas de Salmonella infantis en Buenos Aires, Argentina;21 todas esas cepas fueron resistentes a CTX y GEN.

La presencia de Salmonella infantis productoras de BLEE con similares patrones de resistencia en diferentes áreas geográ.cas de Argentina podría sugerir la diseminación de elementos genéticos móviles entre especies iguales y/o diferentes, incluyendo aquellas pertenecientes a la .ora normal.

La caracterización del tipo de BLEE a través de métodos moleculares podría conducir a un mejor entendimiento de la evolución y diseminación de las familias de â-lactamasas y pueden alertar acerca de la necesidad del uso adecuado de antimicrobianos tanto en salud humana como en aplicaciones animales.

Salmonella infantis con halos de inhibición para CTX £ 27 mm

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por un subsidio de la Fundación Alberto J. Roemmers (Argentina). Los autores desean agradecer al Hospital Clínic i Provincial (Barcelona) por aceptar a L. A. Merino en una pasantía para investigación.

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