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Enfermedades
Infecciosas y Microbiología 2005
Volumen
25, Numero 2, abril-junio |
Diagnóstico de tuberculosis en muestras líquidas por reacción en cadena de la
polimerasa
Maria Lilia Diaz Betancourt,
Ernesto Rodriguez Florez, Julio Cesar Campuzano Rincon, Liz Betty Garcia
Quinonez
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RESUMEN |
ABSTRAC |
|
Antecedentes: El diagnostico de tuberculosis (TB)
mediante Ziehl Neelsen (ZN) y cultivo tiene limitaciones de sensibilidad,
especificidad y rapidez. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
detecta pocas micobacterias especificamente y en 2 días. La sensibilidad y
especificidad en muestras clínicas ha sido variable.
Objetivo: Determinar la utilidad de un PCR para
identificar ADN del complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis),
estandarizada en el laboratorio de Inmunologia y Enfermedades Infecciosas
de la Universidad del Cauca, para diferenciar líquidos corporales con y
sin TB en comparación con ZN y cultivo.
Material y métodos: Se incluyen muestras liquidas
de pacientes con sospecha clínica de TB, u otras enfermedades. Se les
amplifico un fragmento de 245 pb de IS6110 con INS1 e INS2.
Resultados: El PCR fue positivo en 92.30% de 13
pacientes con TB establecida y en 66.66% de 42 pacientes con TB clínica.
Entre 8 muestras de pacientes con TB establecida por cultivo examinadas
también con ZN y PCR, el ZN fue positivo en 50.00% y el PCR en 87.50%.
Entre 24 muestras de pacientes con TB, clínica examinadas por cultivo ZN y
PCR, el ZN y cultivo fueron negativos y el PCR positivo en 62.50%. De 40
pacientes sin TB el PCR fue positivo en 2 muestras dando especificidad de
95%.
Conclusiones: El PCR contribuye al diagnostico de
TB ahorrando tiempo en muestras finalmente cultivo positivo ZN negativas,
y estableciéndolo en 62.50% de casos aceptados como TB solo por clínica.
Sin embargo, en este estudio se debe contemplar la posibilidad de 5% de
falsos positivos.
Palabras clave:
Mycobacterium tuberculosis,
reacción en cadena de la polimerasa, tuberculosis, diagnostico, biología
molecular, micobacteria, Ziehl Neelsen |
Background: The diagnosis of tuberculosis by Ziehl
Neelsen (ZN) stain and mycobacteria culture has low sensibility specially
if the sample is a corporal fluid and Mycobacteria takes weeks for
growing. A few mycobacterias had been detected by PCR in short time,
around two days, but the .delity of this test have been diverse in
relation with different DNA extraction methodology, different primers and
PCR protocols used and laboratory experience.
Objective:To measure the utility of a house PCR
test standarized in Inmunology and Infectious Diseases Laboratory of Cauca
University for detecting M. tuberculosis complex in corporal fluids from
tuberculosis patients in comparison with ZN and mycobacteria culture.
Material and methods: corporal fluids were taken
from patients with clinical symptoms of tuberculosis, cancer, autoimmune
diseases and other infectious diseases. Primers INS1 and INS2 to 245 pb
DNA fragment of IS6110 were
Results: PCR test was positive in 92.3% of 13
corporal .uids from tuberculosis group, probed by culture 12 samples or
smear 1 sample. 8 samples of culture positive patients were tested by ZN
too. In this last group ZN was positive in 50% and PCR in 87.5%. In 24
samples smear and culture negatives from 24 patients with clinical
tuberculosis PCR was positive in 62.5% of samples. PCR was positive too in
2 samples of 2 patients from 40 of no tuberculosis group, speci.city of
95%.
Conclusions: this .ndings show that diagnosis of
tuberculosis in corporal fluids can be made with more sensitivity than
smear and more further than culture. However, is necessary to have in mind
a 5% of false positive results.
Key words:
Mycobacterium tuberculosis,
polimerase chain reaction, diagnosis, molecular biology, Ziehl Neelsen
|
Introducción
La tuberculosis es una enfermedad
remergente que en la actualidad es la primera causa de muerte en el mundo por
enfermedad infecciosa. A pesar de que la etiología fue descubierta desde hace
mas de cien anos, el problema continua creciendo y en 1993 fue declarada
emergencia mundial.1-4
Según datos de la OMS publicados en el 7
informe global sobre TB,5 la enfermedad se esta incrementando en 0.4% cada ano.
En 2001 se informo de 3 801 310 casos de los 8 millones/ano estimados, para una
incidencia global por ano de 60/100 mil habitantes. Colombia notificó a la OMS
11 480 de los 19 970 estimados, tasa de 27 por 100 mil habitantes. En el
Departamento del Cauca la tasa de casos notificados en 2002 fue de 28.32 por 100
mil habitantes, con incremento en comparación con la de 1994, que fue de 17.94
por 100 mil.6
Las limitaciones de las pruebas
diagnosticas es un problema que aun persiste. El ZN requiere entre 5 mil y l0
mil micobacterias/ml de muestra para ser positivo, y el cultivo de 400
micobacterias/ml; la sensibilidad de estas en TB extrapulmonar es hasta de 10% y
de 50%, respectivamente.7-9 En TB pulmonar, 35 % pueden ser tincion negativa y
10% cultivo negativo.10, 11 También en estos casos es importante establecer el
diagnostico rápidamente, ya que se ha informado transmisión de tuberculosis a
partir de ellos en 17%.12
Como una prueba con mejores
posibilidades, pues necesita muy escasa cantidad de micobacterias en las
muestras para ser positivo, el PCR para ampli- .car el ADN de la micobacteria se
ha venido implementando en diversos laboratorios desde la década pasada, con
resultados en sensibilidad variables entre 9 y 100% y especificidad entre 25 y
100%,13 dependiendo de diversos factores, como los oligonucleotidos iniciadores
usados, el tipo de muestra, los métodos utilizados para la extracción del ADN,
los métodos y protocolos para la amplificación y detección de los productos y la
experiencia del laboratorio.
Existen pruebas de PCR comerciales y
caseras, utilizadas mas frecuentemente en esputo y en algunos líquidos como el
pleural y el cefalorraquideo, reportadas en la literatura y recomendadas para
evaluar muestras de esputo tincion positivas, pero aun no hay consenso en la
utilidad de pruebas de PCR para el diagnostico de pacientes con TB tincion
negativa y cultivo positivo, y menos en pacientes con TB bacteriologicamente
negativa diagnosticada con bases clínicas mas respuesta al tratamiento.13-33
La OMS considera también entre los casos
de TB pulmonar aquellos con tres esputos tincion negativa y cultivo negativo,
pero con anormalidades radiológicas sugestivas de TB activa, sin respuesta a
antibióticos, mas tratamiento antituberculoso indicado por un clínico.
Igualmente, la OMS considera entre los casos de TB extrapulmonar aquellos con
cultivo negativo pero con hallazgos histopatologicos compatibles o con evidencia
clínica de actividad tuberculosa mas tratamiento antiTB instaurado por un
clínico.5
En estas circunstancias, una prueba de
PCR que identifique el ADN de M. tuberculosis en forma altamente sensible y
especifica podría contribuir a establecer la TB en muestras tincion y cultivo
negativos y acelerarlo en TB con tincion negativa y cultivo positivo, lo mismo
que diferenciar TB de infección por micobacterias no tuberculosis en las
muestras tincion positiva, mientras el germen crece en el cultivo, lo cual puede
tomar hasta ocho semanas.
En el laboratorio de Inmunologia y
biología molecular de la Universidad del Cauca se estandarizaron las condiciones
apropiadas de un protocolo casero para amplificar con los iniciadores usados por
Kolk AHJ et al. INS1 (5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3) e INS2
(5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3),32 un fragmento de 245 pb del ADN de M. tuberculosis
extraído de cultivo en forma sensible y especifica. El presente estudio pretende
aplicar la prueba ya estandarizada en la evaluación de diferentes muestras
liquidas provenientes de pacientes atendidos en el Hospital Universitario San
José de Popayan (HUSJ), con el objetivo de evaluar la contribución de este PCR
al establecimiento del diagnostico en comparación con el ZN y el cultivo.
Material y métodos
Muestras. Se procesaron las muestras
liquidas corporales enviadas al Laboratorio de Inmunologia y Enfermedades
Infecciosas de la Universidad del Cauca, procedentes de pacientes atendidos en
el HUSJ con sospecha de TB, otras infecciones no TB, cáncer y enfermedad del
colágeno, en el periodo comprendido entre agosto de 1998 y abril de 2000.
Los pacientes fueron clasificados de
acuerdo con el expediente clínico como TB establecida, TB clínica y no TB según
las siguientes definiciones adaptadas para este estudio de las definiciones de
casos de la OMS.5 La clasificación de los casos se hizo en forma ciega al
resultado de PCR, así:
TB establecida: paciente con
cuadro clínico de TB y tincion para bacilos ácido alcohol resistentes positiva o
cultivo positivo para M. tuberculosis.
TB clínica: paciente con cuadro
clínico de TB y respuesta adecuada al tratamiento antituberculoso con pruebas
negativas para otra patología y la muestra examinada para cultivo de
micobacterias negativa.
No TB: paciente con enfermedad no
TB comprobada por laboratorio y respuesta al tratamiento de esa enfermedad y
diagnostico de TB descartado.
Recolección y conservación de las
muestras: Las muestras liquidas de aspirado gástrico, esputo, LCR, orina,
liquido peritoneal, liquido pleural, aspirado de ganglio, lavado broncoalveolar
y secreciones fueron recolectadas espontáneamente, mediante puncion o sonda
según el caso, en recipiente limpio, nuevo, y en seguida fueron transportadas al
Laboratorio y almacenadas a -20° C hasta su procesamiento.
Extracción del ADN: Se utilizo la
técnica informada por Díaz et al.,33 con pequeñas modificaciones. Se tomaron 500
¥ìl de esputo o 1 000 ¥ìl de otros líquidos, se inactivaron las posibles
micobacterias con etanol a concentración final de 70%, se centrifugo y seco. La
lisis se realizo con 50 ¥ìl de lisozima al 3.3% a 37¡Æ C por una hora. Se
adicionaron 30 ¥ìl de SDS al 20% a 65¡Æ C durante una hora, luego l50 ¥ìl de
proteinasa K al 2% e incubación a 55¡Æ C durante l8 horas. La lisis se completo
con 100 ¥ìl de perclorato de Na 3 M durante 10 minutos. La purificacion del ADN
se realizo con cloroformo alcohol isoamilico 24:1 y precipitación con etanol
absoluto en presencia de acetato de Na 3 M a .30¡Æ C durante 2 horas, seguida de
centrifugación a l4 000 rpm. Lavado con etanol al 70%, en seguida secado de las
muestras a temperatura ambiente y suspensión del ADN en agua destilada
desionizada. El ADN fue cuantificado a 260 nm en espectrofotometro UV.
Amplificación: Para este
procedimiento se utilizo también la técnica usada por Díaz et al.33 con pequeñas
modificaciones para el optimo funcionamiento de los iniciadores INS1 e INS2, las
cuales se determinaron en la fase de estandarización.
Mezcla de reacción: Se utilizo
una mezcla de 50 ¥ìl preparada con un buffer de reaccion a concentración final
1X, ClMg 2 mM, dinucleotidos trifosfatados 0.2 mM, formamida 0.5 mg, iniciadores
INS1 e INS2, 40 pmol de cada uno, y 1 ¥ìg de ADN de cada muestra. La mezcla de
reacción fue cubierta con aceite mineral. Se realizo la inactivación de
nucleasas por 5 minutos a 94¡Æ C, y en seguida se adicionaron 0.5 unidades de
Taq polimerasa. Finalmente, fueron procesadas en el termociclador MJ Research
con el siguiente programa: 3 minutos a 95¡Æ C y 44 ciclos por 2 minutos a 95¡ÆC
para la desnaturalización, 2 minutos a 67¨¬ C para la hibridizacion y 2 minutos
a 72¡Æ C con incremento de 0.5 segundos en cada ciclo para la extensión. La
extensión final fue de 7 minutos.
La extracción del ADN, la amplificacion
y la electroforesis se desarrollaron en espacios separados como medida para
prevenir la contaminación, y en cada procedimiento de extracción y amplificacion
de las muestras se incluyeron controles de reactivos sin ADN y ADN de liquido
control negativo para detectar contaminación de las muestras durante los
procedimientos. También se incluyo un liquido corporal control positivo y un
tubo con 1 pg de ADN de M. tuberculosis para detectar posible incorrecto
funcionamiento de la prueba. No se usaron controles de inhibición de PCR en cada
muestra, lo cual es una limitante a tener en cuenta en la interpretación de los
resultados negativos.
Detección de los productos de PCR: Se
realizo mediante electroforesis horizontal para ácidos nucleicos en gel de
agarosa al 1.5%, en buffer TBE 1X, colocando en cada pozo 20 l del producto de
amplificación con 5 l de una mezcla de xylene cyanole y azul de bromofenol. Los
productos se compararon con un marcador de peso molecular, ladder 123 pb o con
un fragmento de 245 pb obtenido en el laboratorio por PCR del ADN de M.
tuberculosis.
Resultados
Con el protocolo estandarizado, el
fragmento de 245 pb empieza a detectarse a partir de la amplificacion de 1 fg de
ADN extraido de cultivo de M. tuberculosis (Figura 1 A) y no amplifica el ADN de
micobacterias diferentes al Complejo M. tuberculosis: M. kansasii y M. avium
intracellulare, ni el ADN de Histoplasma capsulatum y tampoco el ADN de células
humanas.
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 |
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|
Figura. 1. Sensibilidad del
PCR en ADN de cultivo y muestra clínica. A Sensibilidad en ADN de cultivo
de M. tuberculosis. Gel de agarosa tenido con bromuro de etidio. Las
líneas muestran la amplificacion de diferentes cantidades de ADN del
cultivo de M. tuberculosis. 1) 1 g, 2) 500 fg, 3) 10 fg, 4) 1 fg, 5)
Marcador de peso molecular ladder 123 pb. B. Sensibilidad en ADN de LCR
positivo para M. tuberculosis por cultivo. Gel de agarosa al 1.5% tenido
con Bromuro de etidio. Las líneas muestran la amplificacion de diferentes
cantidades de ADN del LCR de un paciente con aislamiento de M.
tuberculosis. 1) 2 g, 2) 1 g 3)1ng, 4)1 pg, 5) 500 fg, 6) Reactivos sin
ADN, 7) Marcador de peso molecular ladder 123 pb. El fragmento de 245 pb
esperado se observa hasta con 500 fg del ADN de la muestra. |
Se busco la sensibilidad del PCR en el
ADN de un LCR con cultivo positivo en el cual la prueba amplifico el producto
esperado a partir de 500 fg del ADN de la muestra (el ADN cuantificado aquí
consta de ADN de diferentes células de la muestra clínica, mas el de las
micobacterias contenidas en ella, a diferencia del anterior, que es solo de
micobacterias). La mejor visualización del fragmento se obtiene cuando se
utiliza entre 1 y 3 g del ADN (Figura 1 B).
En el grupo de TB establecida se
tuvieron 13 pacientes (las muestras fueron 5 de orina, 2 líquidos peritoneales,
y uno de cada uno de los siguientes: jugo gástrico, aspirado testicular, liquido
pleural, aspirado de ganglio, LCR y esputo). El PCR fue positivo en 12 de estos
pacientes, para una sensibilidad en este grupo del 92.30%. Del cultivo de estas
muestras, el del esputo se contamino, por lo cual no se aisló M. tuberculosis.
El cultivo de las 12 muestras restantes fue positivo para M. tuberculosis.
El PCR fue positivo en 11 de las 12
muestras liquidas cultivo positivo, dando una sensibilidad del PCR de 91.66% en
relación con el cultivo (Cuadro 1). De los cinco pacientes cuya muestra recogida
fue orina, no se realizo tincion de ZN a 4 muestras. Al comparar el ZN de las 9
muestras de los pacientes restantes con las pruebas de PCR se encontró que el
PCR fue positivo en 8, dando una sensibilidad de 88.88% versus 5 ZN positivas,
sensibilidad de 55.55%. Cuando la comparación se realiza solo con las muestras
procesadas con las tres metodologías, la sensibilidad del PCR frente al cultivo
es de 87.5% y la del ZN 50%. Es de tener en cuenta que la muestra que tuvo
resultado negativo en la tincion concordó con una prueba de PCR negativo (Cuadro
1).
En el grupo de TB clínica se tuvieron 42
pacientes con muestras liquidas procesadas por PCR y cultivo (18 orinas, 11
esputos, 6 LCR, 3 liquido pleural, 2 liquido peritoneal y 1 de cada uno de
lavado bronquioalveolar y aspirado gástrico), el PCR fue positivo en 28 (66.66%,
Cuadro 2). De las 42 muestras, se realizo también tincion de ZN a 24, las cuales
fueron todas negativas. Las muestras no examinadas por ZN fueron 17 orinas (el
ZN es totalmente inespecífico por la posibilidad de M. smegmatis) y un esputo.
Entre estas 24 muestras procesadas para las tres pruebas, el PCR fue positivo en
62.50% (Cuadro 2).
También se procesaron 40 líquidos de
pacientes no TB; 95% fueron PCR negativos. Un esputo de una paciente con cáncer
de colon metastático a pulmón y una orina de una paciente con glomerulopatia
lupica fueron los falsos positivos (Cuadro 3).
|
Cuadro 1
Resultados de
cultivo, PCR y ZN en pacientes con TB comprobada |
|
Muestra |
No.
|
Cultivo No |
PCR No |
ZN No |
NR |
|
Positivo |
Negativo |
Positivo |
Negativo |
Positivo |
Negativo |
|
Orina |
5 |
5 |
|
5 |
|
|
1 |
4 |
|
L. peritoneal |
2 |
2 |
1+ |
1 |
1+ |
1 |
1+ |
|
|
A. gástrico |
1 |
1 |
|
1 |
|
1 |
|
|
|
A. testículo |
1 |
1 |
1+ |
1 |
|
1 |
|
|
|
L. pleural |
1 |
1 |
|
1 |
|
1 |
|
|
|
A. ganglio |
1 |
1 |
|
1 |
|
|
1 |
|
|
Esputo |
1 |
|
|
1 |
|
1 |
|
|
|
LCR |
1 |
1 |
|
1 |
|
|
1 |
|
|
Total |
13& |
12 |
|
12 |
1+ |
5 |
4 |
4 |
|
* Cultivo contaminado, **ZN
negativo, + PCR negativo, NR:
muestras no teñidas con ZN, & B
muestras procesadas por las 3 metodologías. |
|
Cuadro 2
Resultados del
ZN, cultivo y PCR en muestras de pacientes con TB clínica |
|
Muestra |
No.
|
ZN |
Cultivo |
PCR |
|
Positivo |
Negativo |
Positivo |
Negativo |
Positivo |
Negativo |
|
Orina |
18 |
0 |
1 |
0 |
18 |
13 |
5 |
|
Esputo |
11 |
0 |
10+ |
0 |
11 |
8 |
3 |
|
LCR |
6 |
0 |
6 |
0 |
6 |
4 |
2 |
|
L. pleural |
3 |
0 |
3 |
0 |
3 |
2 |
1 |
|
L. peritoneal |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
|
A.
gástrico
|
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
|
L.
broncoalveolar |
1 |
|
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
|
Total |
42& |
0 |
24 |
0 |
42 |
28 |
14 |
|
7* 1 PCR positivo, & 24
muestras fueron procesadas por las 3 metodologías
a 17 orinas y un esputo no se
les realizó ZN. |
Cuadro 3
Resultados del ZN,
cultivo y PCR en muestras de pacientes con TB clínica
|
Muestra |
No.
|
Cultivo No |
NR |
PCR No |
ZN No |
|
Positivo |
Negativo |
Positivo |
Negativo |
Positivo |
Negativo |
|
Esputo |
9 |
0 |
7 |
2 |
0 |
7 |
1 |
8 |
|
L. ppleural |
8 |
0 |
5 |
3 |
0 |
4 |
0 |
8 |
|
LCR |
6 |
0 |
5 |
1 |
0 |
5 |
0 |
6 |
|
L. peritoneal |
6 |
0 |
2 |
4 |
0 |
2 |
0 |
6 |
|
Orina |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
4 |
1 |
4 |
|
L. articular |
2 |
0 |
2 |
0 |
0 |
2 |
0 |
2 |
|
L. broncoalveolar |
2 |
0 |
2 |
0 |
0 |
2 |
0 |
2 |
|
A. médula ósea |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
|
Jugo gástrico |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
|
Total |
40 |
0 |
23 |
17 |
0 |
27 |
2 |
38 |
|
* Cultivo contaminado, **ZN
negativo, + PCR negativo, NR:
muestras no teñidas con ZN, & B
muestras procesadas por las 3 metodologías. |
Discusión
Los resultados que aquí presentamos
demuestran que el protocolo estandarizado detecta una cantidad de ADN del
Complejo M. tuberculosis tan pequeña como 1 fg y en forma especifica, ya que no
se genera amplificación en el ADN de otras micobacterias, otros microrganismos
ni en el ADN humano.
La prueba también detecto el fragmento
de 245 pb esperado hasta en 500 fg de ADN extraído del LCR cultivo positivo, y
el mejor resultado se obtuvo cuando la cantidad de ADN usado fue entre 1 y 3 g.
Este hallazgo concuerda con lo informado por Marchetti et al., quienes reportan
una influencia de la cantidad de ADN de la muestra en la efectividad de la
amplificación.35 Por lo tanto, es recomendable que para amplificar ADN de
muestras clínicas se use una cantidad conocida, en este rango, para este
protocolo.
La utilización del PCR en la búsqueda
del ADN de M. tuberculosis en muestras liquidas provenientes de pacientes con TB
establecida por cultivo 12 casos y ZN 1 caso con una sensibilidad de 92.30%, es
comparable a protocolos caseros que han utilizado iniciadores para fragmentos de
la secuencia del complejo M. tuberculosis IS6110, entre ellos el estudio de Eing
et al., quienes reportaron 91.08% de sensibilidad.19 Los iniciadores para
amplificar fragmentos de esta secuencia han mostrado la mejor sensibilidad en
comparación con otros blancos del genoma de la micobacteria, ya que esta se
encuentra en forma repetida hasta 20 veces en cepas de M. tuberculosis.
Esta sensibilidad es también mejor que
la encontrada en estudios que utilizan protocolos comerciales. Entre ellos, el
Amplicor de Roche mostró un 60% de sensibilidad en LCR procedente de pacientes
con TB establecida y probable (datos publicados en el estudio de Bonington et
al.22), y el Cobas Amplicor de Roche mostró sensibilidad del 66.3% en el ya
citado de Eing et al.19 Esto ha sido explicado por diferente capacidad de los
procedimientos usados en los distintos protocolos de extracción del ADN para
lisar las micobacterias y la inhibición de la amplificación, la cual es mayor
cuando se usa el ADN sin purificación después de tratamiento con proteinasa K en
los protocolos comerciales.31
El protocolo aquí utilizado incluye
incubación con lisozima, detergente y proteinasa K en un tiempo de incubación
prolongada, y también incluye purificación del ADN con cloroformo isoamilico y
etanol. Estos hechos probablemente aseguran una mayor lisis de las micobacterias
y menor inhibición. No obstante, el único PCR falso negativo en este grupo de
muestras podría deberse a inhibición de la amplificación, dado que no se
determino esta posibilidad.
Entre 8 muestras de pacientes con TB
establecida por cultivo y examinadas también para ZN y PCR, el PCR es mas
sensible que el ZN, 87.50% versus 50%. La positividad del PCR en muestras ZN
negativo permite adelantar el diagnostico, ya que el crecimiento de M.
tuberculosis puede tardar hasta dos meses, versus dos dias del PCR. La demora en
el diagnostico conlleva atrasos en el tratamiento, gastos en la búsqueda de
diagnósticos alternativos, deterioro del paciente y, sobre todo, riesgo en la
transmisión de TB, como se estableció en el estudio de Behr et al., quienes
informaron 17% de transmisión a partir de enfermos con TB pulmonar tincion
negativa.12 De otro modo, en las muestras ZN positivas también el PCR ofrece la
ventaja de adelantar la clasificación de la micobacteria entre ser del Complejo
M. tuberculosis o una micobacteria no tuberculosis, lo cual es importante sobre
todo cuando se trata de pacientes inmunocomprometidos que pueden ser afectados
por estas ultimas.
La sensibilidad del PCR en las 24
muestras evaluadas por las tres metodologías de pacientes con TB definida como
clínica de acuerdo con lo aceptado por la OMS, fue de 62.5%, comparable a la
sensibilidad del PCR en las 42 muestras de todos los pacientes de este grupo,
66.66%.
En estas circunstancias, el PCR seria la
única evidencia biológica de la presencia de M. tuberculosis en los casos hasta
ahora definidos y tratados sobre bases únicamente clínicas, debido a las
conocidas limitaciones de los estándares de oro micobacteriologicos actuales, el
ZN y el cultivo. Sin embargo, esta interpretación estaría afectada en su
utilidad por la especificidad de la prueba, que en este estudio es de 95% y
obliga a tener en cuenta un 5% de falsos positivos.
De otra manera, aun utilizando el PCR
entre los pacientes con TB clínica, queda un 33.3% de pacientes que continuarían
en tratamiento antituberculoso con base en el criterio clínico; aquí es
pertinente plantear las siguientes hipótesis: 1. Estos casos son falsos
negativos del PCR, por inhibición de la prueba o porque el numero de
micobacterias es tan pequeño que el ADN blanco dentro del ADN de las demás
células de la muestra no alcanza a ser amplificado o se pierde o degrada durante
los procesos de extracción; y 2. Estos son casos de otras patologías no
tuberculosas, benignas, que mejoran sin un tratamiento especifico, por ejemplo
infecciones virales.
Estas hipótesis requieren estudios
diseñados para investigarlas y para la búsqueda de un estándar de oro con mejor
efectividad que la tincion y el cultivo. Las muestras falsas positivas entre las
40 patologías no TB analizadas en este estudio corresponden a esputo de una
paciente con cáncer de colon metastasico al pulmón, y orina de una paciente con
glomerulopatia lupica. La positividad en estas muestras podría deberse a
infección tuberculosa no activa, ya que se ha informado amplificación de ADN de
M. tuberculosis en tejidos de autopsias donde no se encontro otra evidencia de
enfermedad,16 o a contaminacion de las muestras en alguno de los pasos del
procesamiento. Este ultimo mecanismo parece improbable debido a que los
controles de contaminacion para estos experimentos no la evidenciaron.
La alta positividad de la prueba
encontrada en las muestras de orina examinadas por este protocolo de PCR, 13 de
18 en el grupo de TB clinica mas la unica en el grupo de TB establecida, podría
llegar a ser de gran valor en el abordaje de pacientes con sospecha de TB de
vias urinarias, ya que en esta entidad el ZN no tiene valor por la falta de
especificidad para diferenciar la micobacteria visualizada bajo tincion respecto
de M. smegmatis, que es una micobacteria saprofitica en estos órganos, así que
un PCR positivo en estos casos podría establecer rápidamente la diferencia sin
tener que esperar hasta 8 semanas que los cultivos positivos presenten
crecimiento.
Las orinas positivas por PCR de ambos
grupos de pacientes provenían: 2 de pacientes con enfermedad tuberculosa de vías
urinarias y el resto de pacientes con compromiso en otros órganos como 2 de la
columna, 10 con TB miliar y 4 de pacientes con TB pulmonar. Considerando que la
orina es una muestra de fácil recolección en la mayoría de los individuos y sin
necesidad de manipulación invasiva, este hallazgo podría convertir a la muestra
de orina en muy útil para establecer el diagnostico de TB y con mayor
efectividad que la amplificación de ADN en sangre, cuya sensibilidad reportada
por Ahmed et al. en sangre de pacientes con TB pulmonar fue de 43.75% utilizando
iniciadores para INS6110.36 La muestra de orina seria muy útil cuando la TB se
halla localizada en órganos de difícil acceso o que requieren procedimientos
invasivos para lograrlo. En general, para todas las otras muestras liquidas su
recolección es mas sencilla que la toma de muestras de tejidos, y examinar los
líquidos por PCR podría ahorrar no solo dinero y tiempo sino bienestar del
paciente que podría ser menos sometido a procedimientos invasivos.
En resumen, el diagnostico de la TB con
los métodos tradicionales de tincion y cultivo para micobacterias tiene aun
grandes dificultades. Afortunadamente se ha incrementado el numero de estudios
aplicando la PCR en diferentes muestras clínicas, dado que se ha informado de
grandes variaciones en la sensibilidad, especificidad y valores predictivos
negativo y positivo, congruentes con la, también, gran variabilidad en los
protocolos de extracción, amplificación, detección del producto, secuencia
blanco e iniciadores utilizados en los estudios comparados.
Se requiere una selección de los mejores
protocolos a utilizar y una evaluación de su desempeño entre los diferentes
laboratorios. El protocolo utilizado, a pesar de no incluir búsqueda de
inhibidores en las muestras negativas y evaluar un numero no muy grande de
muestras, concuerda en sensibilidad y especificidad con los mejores valores
publicados para estos parámetros en protocolos usados para amplificar fragmentos
de esta secuencia de inserción.
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