Enfermedades Infecciosas y Microbiología 2004

Volumen 24, Numero 3, julio-septiembre

 

 

Métodos convencionales y moleculares para la identificación y tipificación de Streptococcus pyogenes

Química farmacobióloga. Hospital de Pediatría, Centro Médico de Occidente.

Doctor en Ciencias Médicas, Pediatra Infectólogo, Instituto Mexicano del Seguro Social. Guadalajara, Jalisco.

 

 

RESUMEN

ABSTRAC

El Streptococcus pyogenes es una bacteria Gram positiva de gran relevancia en la clínica debido a su asociación tanto con infecciones supurativas (faringo-amigdalitis, impétigo, fiebre escarlatina, fascitis necrotizante), como no supurativas (fiebre reumática, glomerulonefritis, síndrome de choque tóxico). Para su identificación, desde el siglo pasado se han empleado diversos métodos que usan antisueros para el reconocimiento del Grupo A con base en su carbohidrato de pared, o bien el de serotipos con base en la adherencia de anticuerpos opsónicos que reconocen secuencias de aminoácidos específicas de la región N-terminal de la proteína M. En las últimas décadas, su caracterización se ha enfocado a la identificación de los productos de su expresión génica o a diversas formas de análisis de porciones de su genoma. Estos últimos métodos han permitido además la distinción de clonas entre cepas aisladas de pacientes relacionados o de brotes. En el presente artículo se ofrece una revisión exhaustiva tanto de los métodos serológicos como moleculares para la identificación y caracterización de esta bacteria.

 

Palabras clave: Streptococcus pyogenes, tipificación convencional, tipificación molecular

Streptococcus pyogenes is a Gram po-sitive bacteria associated with both suppurative (tonsillitis, impetigo, scarlet fever, necrotizing fasciitis) and non-su-ppurative infections (rheumatic fever, glomerulonephritis, toxic shock syndro-me). Since the last century, it has been used several methods that uses antisera to recognize and identify Group A streptococci based upon the recognition of the cell wall carbohydrate, as well as S. pyogenes serotypes based upon the use of specific opsonic antisera that recognizes specific amino acid sequences of the N-terminal region of the M protein. In the last decades, characterization of S. pyogenes has focused in the identification of gene expression products or the analysis of portions of its genome. These methods have allowed identifying clones between strains from related patients or the ones isolated during an outbreak. In this manuscript, we performed a comprehensive review of both serologic and molecular methods for identifying and for the characterization of this bacterium.

 

Key words: Streptococcus pyogenes, conventional typing, molecular typing

 

 

Introducción

 

El Streptococcus pyogenes o Estreptococo beta hemolítico del grupo A (EbHGA) es una bacteria Gram positiva que de acuerdo con la clasificación de Lancefield corresponde al grupo A. Esta bacteria es de gran relevancia en la clínica debido a que se asocia tanto a infecciones supurativas (faringitis, impétigo y fiebre escarlatina), como no supurativas (fiebre reumática, glomerulonefritis).1 Para su identificación y caracterización se han desarrollado métodos serológicos y no serológicos basados en la identificación de productos de la expresión genotípica de la bacteria, tales como las proteínas o carbohidratos de su superficie, o en el análisis de porciones de su DNA o RNA genómico.2 Estos métodos permiten no sólo su identificación y tipificación sino también su diferenciación en clonas (grupos distintos originados a partir de un mismo gen inicial).

 

En la actualidad, los avances en el conocimiento de la biología molecular y de la ingeniería genética han permitido el desarrollo de técnicas para la identificación de tipos de EbHGA con base en su gen emm (tipificación emm), el cual expresa para la proteína M, específica de cada serotipo. Este método permite la identificación de cualquier cepa el mismo día y sin la necesidad del uso de antisueros.3

 

 

Identificación primaria de S. pyogenes

 

La identificación del Streptococcus pyogenes en el laboratorio de microbiología se inicia con la selección de colonias sugestivas beta hemolíticas en un cultivo primario en placas de gelosa sangre de carnero al 5% (GSC5%). Las colonias tienen un diámetro aproximado de 0.5 mm, y pueden ser mucoides (ricas en ácido hialurónico) o de superficie despulida, redondeadas y de color grisáceo a opalescente.4

 

Las pruebas presuntivas en la identificación del EbHGA se basan en la susceptibilidad e inhibición del crecimiento en una placa de gelosa sangre de carnero, y que tienen la mayor parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto con discos que contienen dosis bajas (0.04U) de bacitracina (TAXO A),5 o a la capacidad de la mayoría (98%) de las mismas para hidrolizar la pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR).1, 6-8

 

La placa de gelosa sangre es incubada a 35° C durante toda la noche para la prueba de bacitracina y 30 minutos para la prueba de PYR. La prueba de PYR es positiva cuando al agregar una gota de revelador (N-N dimetilaminocinamaldehido) sobre el disco de PYR, éste se torna de un color que va de rosa a rojo. Para la prueba de bacitracina los resultados son cualitativos y es positiva si se encuentra cualquier halo de inhibición alrededor del disco.9

 

La prueba definitiva o confirmatoria se realiza mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra los carbohidratos de pared, unidos en su porción Fc a partículas de látex, con lo que se identifican aquéllos pertenecientes a los grupos A, B, C, D y F.10 Existen pruebas rápidas basadas en la extracción del carbohidrato de pared de muestras de hisopados faríngeos que identifican sólo a estreptococos del grupo A mediante una prueba de inmunoensayo óptico. Aunque estas pruebas no logran una identificación de serotipos, permiten identificar la presencia de EbHGA en los siguientes 10 o 20 minutos posteriores a la toma de muestra.11 12

 

 

Técnicas de tipificación serológíca

 

Es la técnica más usada para la identificación de serotipos; es utilizada en epidemiología para evaluar la distribución de diferentes serotipos, así como la vigilancia de brotes de infecciones asociadas a EbHGA. Estas técnicas se basan en la unión visible y en algunos casos cuantificable de un antígeno (Ag) tal como la proteína M, T, R o el factor de opacidad (FO) de EbHGA con anticuerpos (Ac) presentes en un antisuero serotipo específico.1, 6, 13 Esta técnica requiere la extracción del antígeno de interés a partir de colonias puras de un cultivo y su mezcla con los antisueros específicos de referencia.

 

La tipificación de S. pyogenes con base en la proteína M es la más usada y depende de la variabilidad antigénica de la región N-terminal de la misma. Los mecanismos para esta variabilidad pueden generarse por recombinación homóloga, mutaciones de inserción de nucleótidos y otros mecanismos que puedan afectar el gen emm (que codifica para la expresión de la proteína M).14, 15

 

La secuencia de aminoácidos de esa región y su reconocimiento por anticuerpos específicos son la base para la identificación de diferentes serotipos, de los que han reconocido alrededor de 80. Para este propósito se realizan ensayos de inmunoprecipitación en portaobjetos, en capilares sin heparina (microprecipitación) o mediante inmunodifusión en gel de agarosa (Outcherlony).

 

La serotipificación de cepas de EbHGA mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra la proteína T es utilizada, además de la tipificación M, para la identificación de más del 95% de las cepas. Algunos antígenos T son exclusivos de un tipo M, mientras que otros pueden ser compartidos por varios tipos M.2, 4 Se ha descrito que algunos serotipos T (1, 3, 4 y 12) son productores de NAD-glicohidrolasa (factor de virulencia), por lo que esta serotipificación también ofrece una herramienta en la identificación de cepas virulentas de S. pyogenes.16

 

Otra proteína utilizada para la tipificación serológica es la lipoproteína de alta densidad llamada factor de opacidad (FO).15 Cepas que pertenecen a ciertos serotipos M tienen la capacidad de producir opacidad del suero de algunos mamíferos (caballo), como resultado de la acción de esa enzima (por ejemplo, serotipos 2, 4, 9, 11, 13, 22, 25, 28, 48, 49, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 73, 75, 76, 77, 78, 79 y 81), mientras que todo otro grupo de serotipos M no tienen esa capacidad. Esta enzima es secretada durante el crecimiento bacteriano, por lo que se facilita su extracción del caldo de cultivo.4 El procedimiento para la identificación de FO se basa en la inhibición específica de FO con un antisuero que contiene Ac AntiFO. El resultado de esta tipificación permite identificar los serotipos M que podrían estar involucrados en uno u otro grupo.2

 

La proteína R no es exclusiva de EbHGA, ya que también se encuentra en estreptococos de los grupos B, C y G.17 Esta proteína no se asocia a la virulencia, es resistente a la tripsina y sensible a ácidos y álcalis. La tipificación se establece con la detección de 4 diferentes serotipos de proteína R clasificados como R1, R2, R3 y R4. Sólo algunas cepas como serotipos M- 2, 3, 28, 33, 43 y 48 son portadores de una o varias de estas proteínas R, por lo cual su utilidad en la serotipificación es muy limitada.2

 

Los métodos serológicos antes descritos permiten la identificación, clasificación y vigilancia epidemiológica de serotipos de S. pyogenes asociados a padecimientos infecciosos. Sin embargo, tienen la limitante de requerir antisueros cuya disponibilidad se limita a pocos laboratorios de referencia en el mundo.18 Además, son técnicas que limitan la identificación de serotipos no incluidos en los bancos de antisueros, como es el caso de cepas no tipificables asociadas a piodermias en México y países de América del Sur. Tampoco son capaces de discriminar entre clonas pertenecientes a un mismo serotipo.19-21

 

 

Técnicas de identificación o tipificación no serológíca

 

Espectrometría con pirolisis de masas. Es un método automatizado para la comparación de cepas de S. pyogenes posiblemente asociadas,22 y consiste en la transformación de una muestra que contiene la cepa en pirolitos, los cuales son separados y analizados por un espectrómetro de masas de acuerdo con el cociente de su masa sobre su carga (m/z), lo que produce un espectro o perfil químico único para cada cepa. Este método ofrece la ventaja de ser muy sensible y rápido (comparación en 2 minutos), y las desventajas de requerir la compra de un equipo caro y de ser manejado por personal capacitado.2

Quimioluminicencia. Este método utiliza una prueba directa para identificar cepas de EbHGA (Direct test; Gen-Probe, Inc., San Diego, CA), que se basa en la hibridación de ácidos nucleicos para detectar una secuencia única de RNA ribosomal (rRNA) extraída directamente de hisopados faríngeos. La hibridación ocurre entre una secuencia de DNA marcada con un ester de acridina y la secuencia de rRNA procedente de la muestra. El híbrido DNA-RNA es identificado y cuantificado en unidades relativas de luz (RLU) por un luminómetro, cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de hibridación ocurrida. Steed y cols. emplearon esta técnica en especímenes de 227 pacientes con faringitis, demostrando que la técnica es rápida, sensible (97%) y específica (96-98%) para la identificación de cepas de S. pyogenes directamente de especímenes faríngeos.23

 

Citometría de flujo. Es un método importante para investigación biomédica que puede ser utilizado para el diagnóstico de infecciones estreptocócicas. Por ejemplo, en un paciente con faringitis aguda, se toma un hisopado de la faringe y la muestra es puesta en una solución; luego se agregan anticuerpos fluorescentes dirigidos contra el polisacárido específico de grupo (polisacárido C). Luego, las células y bacterias de la faringe son transportadas e impulsadas por el flujo de una solución isotónica hasta el punto de medición o cámara de flujo, la cual separa en forma individual las células, que pasan a través de un haz luminoso láser que provoca la excitación de los marcadores fluorescentes unidos a cepas con el polisacárido específico de grupo. Esto desencadena una emisión de luz en cada una de las células de S. pyogenes que las identifica.24

 

Hibridación in situ por fluorescencia. Ésta es una de las técnicas más usadas para la identificación de patógenos asociados a infecciones invasivas. Este método utiliza sondas de DNA diseñadas para la identificación de fragmentos de rRNA específicos de S. pyogenes. El uso de esta técnica ha sido exitosa en la identificación directa de cepas de pacientes con enfermedades invasivas (fascitis necrotizante) en las 3 horas posteriores a la toma de la muestra (tejido del paciente), lo que ayuda a tomar una rápida decisión terapéutica que redunda en una oportuna atención del paciente y una mejora en el pronóstico del mismo.25

 

Ribotipificación. Este método permite la identificación de grupo y la tipificación en clonas de EbHGA. Se basa en la detección y análisis de la fracción 16s del RNA ribosomal que es codificada por un gen común presente en todas las bacterias (gen 16s rDNA). Este gen esta constituido por una región variable y una conservada para cada especie, por lo que su identificación mediante métodos moleculares como polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (con sus siglas en inglés RFLP) y ensayos de hibridación, permite identificar a los estreptococos de acuerdo a su grupo, así como tipificar clonas de cepas de S. pyogenes con una sensibilidad y especificidad de 90%.26 Debido a que el gen 16s rDNA tiene una tasa de expresión alta (7X104), suele obtenerse en cantidades apropiadas para su uso.27

 

Para la detección de grupo se emplea una PCR que amplifica una fracción de dicho gen (996 pb), que después es sometido a digestión enzimática con HaeIII, obteniéndose un patrón característico de estreptococos del grupo A. En otros estudios de ribotipificación se analizan regiones de genes rDNA mediante secuenciación de los espacios íntergénicos de los rDNA 16s y 23s;28 existen 7 regiones bien caracterizadas que pueden también ser utilizadas para la identificación de grupo en cepas de estreptococos. 29

 

Para la identificación de clonas de EbHGA se utilizan ensayos de hibridación tipo Southern blot mediante sondas de ADN diseñadas con base en el gen 16s rDNA, por medio de una PCR convencional. Se utiliza uracilo marcado con biotina o digoxigenina para la amplificación de una región de 1 063pb. Luego, el fragmento es sometido a digestión con enzimas de restricción sacI, XhoI o EcoRI, y los productos se corren en un gel de agarosa, el cual es sometido al ensayo de hibridación. Los patrones de bandas obtenidos para cada cepa son comparados y con ello se identifican y tipifican las diversas clonas.18 Este método ha demostrado ser reproducible, discriminatorio, sensible y específico (90%);6 sin embargo, posee menos poder de discriminación que la digestión enzimática del DNA total,28 ya que sólo provee información de regiones específicas dentro del genoma de EbHGA 26.

 

Polimorfismos de enzimas. Identifica y tipifica en forma rápida grupo y serotipo de cepas de S. pyogenes por medio de comparación de patrones de RFLP del genoma total de la bacteria con polimorfismos presentes en enzimas, como deshidrogenasa láctica (LDH), fosfoglucoisomerasa (NSP), hidroxibutirato deshidrogenasa (HBD), adenilato cinasa (ADK) y nucleósido fosforilado (PGI).30

 

Inmunoensayo óptico. Una de las técnicas más rápidas para la identificación de estreptococos del grupo A. Se basa en un cambio en la reflexión de la luz11, 12 ocasionado por la unión del Ag (polisacárido C) con su Ac específico inmovilizado en una placa de silicón; método altamente sensible y específico para identificación de estreptococos del grupo A.31

 

Tipificación de fagos. Este método es utilizado para tipificar cepas de S. pyogenes en genotipos M y se basa en la susceptibilidad a la infección (patrón de lisis) por un panel definido de bacteriófagos.32 Los bacteriófagos asociados a infección de cepas de S. pyogenes desempeñan un papel importante en la dirección de la síntesis (gen speC y speA) de enzimas y toxinas como las exotoxinas pirogénicas y eritrogénicas, muralisina, lisina, N-acetilmuramil-L-alanina y amilasa presentes en los genotipos M 1, 3 y 49 y con menor frecuencia en los M 2, 4, 6 y 12.1, 2 El empleo de esta técnica proporciona no sólo la tipificación de S. pyogenes sino información importante sobre la virulencia de la cepa. Una de las desventajas es que requiere de un panel de bacteriófagos de referencia, así como de personal capacitado para la correcta interpretación de resultados.

 

Tipificación de bacteriocinas. Las bacteriocinas son proteínas con función bactericida que se comportan como antibióticos. Son producidas, inhibidas o captadas por algunas especies de bacterias como el S. pyogenes. La tipificación de genotipos de S. pyogenes con base en estas proteínas ha demostrado ser útil en el estudio de infecciones intrahospitalarias ocasionadas por cepas de genotipos M asociados a complicaciones supurativas, tales como el 49, 52 y 55.6 La tipificación se basa en la sensibilidad (Tipificación S) a estas biomoléculas o en la producción de sustancias inhibidoras de proteínas parecidas a bacteriocinas, mejor conocidas como bacteriocina-like (Tipificación P).

 

Los factores que pueden alterar los resultados de esta prueba son: condiciones del medio de cultivo (marca utilizada), temperatura de incubación y ausencia de anaerobiosis. En general estas técnicas son simples y no requieren de gran cantidad de reactivos; sin embargo, son limitadas dado que no alcanza el poder de discriminación de cepas en clonas como lo hacen las técnicas de ribotipificación y secuenciación de ADN. Además, se requiere una colección de cepas productoras y susceptibles a bacteriocinas. Estas moléculas son marcadores constantes de algunos genotipos M y brindan información de resistencia a antimicrobianos de uso común.33-35

 

Tipificación con base en el gen de la proteína M. El gen emm de S. pyogenes codifica para la expresión de la proteína M, que posee una región conservada y una hipervariable. La región hipervariable contiene la fracción de la proteína M responsable del serotipo, por tanto el uso de técnicas para secuenciar, hibridar, amplificar o digerir36 la fracción del gen emm que expresa esta región nos permite conocer no sólo su correspondencia con el serotipo M de cualquier cepa, sino identificar clonas dentro del mismo serotipo.37 Hasta la fecha se han descrito aproximadamente 200 tipos emm y su secuencia se encuentra disponible en la página electrónica http://www.cdc.gov/hcidod/biotech/infotech_hp.html.4

 

Estas técnicas proveen información sobre variaciones naturales del gen emm y se describen como un mapa de la estructura genética que sirve de herramienta para entender la evolución, diversidad y epidemiología de enfermedades asociadas a esta bacteria.38 Además, tienen un 100% de sensibilidad y especificidad.1, 6, 39 Una limitante de esta técnica es la necesidad de contar con el equipo necesario para secuenciar.15, 37

 

Electroforesis en gel de campos pulsados. Mediante el uso de esta técnica se logra separar fragmentos de ADN mayores a 20 kilo pares de bases (Kpb) en un gel de agarosa. La separación se logra gracias a los cambios de dirección en el campo eléctrico originado por los electrodos distribuidos alrededor del gel, consiguiendo que las moléculas se desplieguen y avancen a través de los poros de la agarosa en conformación distendida. Esta herramienta es usada para separar productos de una amplificación aleatoria del ADN total de S. pyogenes mediante su digestión enzimática, obteniendo patrones (polimorfismos) que son comparados para establecer la relación clonal entre diversas cepas.6

 

Para la digestión se utilizan algunas enzimas de restricción (HindIII, SfiI y PvuII ),40 que cortan el genoma generando un patrón de 10-20 bandas en el rango de 1 a 20 Kpb para cada clona.41, 42 La técnica puede ser completada en 24 horas, es altamente sensible y posee un poder de discriminación mayor que la de ribotipificación y multilocus, y algunos de los patrones producidos son exclusivos de ciertos genotipos M,28 lo que convierte a esta técnica en herramienta útil en estudios epidemiológicos de identificación de genotipos y clonas de S. pyogenes.43, 44

 

Amplificación aleatoria de polimorfismos de ADN (RAPD). Este método es capaz de identificar y tipificar clonas de EbHGA, empleando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con una temperatura de alineación baja (38°C), para favorecer la unión de un oligonucleótido de ADN de secuencia aleatoria con la secuencia del ADN genómico de S. pyogenes. Algunos de los oligonucleótidos empleados en este método son H2-CCTCCCGCCCACC y M13-TTATGTAAAACGAC GGCCAGT.

 

Los fragmentos amplificados varían entre 190 y 1 500 pares de bases (pb). Este método tiene un poder de discriminación alto, ya que al amplificar secuencias aleatorias con iniciadores inespecíficos permite amplificar secuencias no conocidas. Cabe señalar que el poder de discriminación de este método aumenta si se utilizan varios oligonucleótidos. Sin embargo, una desventaja de este método es que es muy laborioso y los perfiles obtenidos no son comparables entre laboratorios, ya que en cada corrimiento se obtienen patrones diferentes de digestión debido a la amplificación aleatoria.45, 46

 

Tipificación del regulón vir. El regulón vir es una región del genoma del EbHGA con genes que codifican para los factores de mayor virulencia de esta bacteria, como el gen para el receptor de la fracción cristalizable (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) (FcrA), el gen de la proteína M (emm) y el de las proteínas fijadoras de la inmunoglobulina A (IgA) (enn). Además, el gen emm está flanqueado por dos genes; el gen de la C5a peptidasa (scpA) y el gen regulador virR (mry), cuya función es esencial para la expresión de todos los componentes del regulón. Estos genes presentan polimorfismos que pueden ser observados y analizados fácilmente por medio de la amplificación (4 a 7 pb) y digestión enzimática del regulón.47 En general este es un método sencillo, rápido y altamente discriminatorio para identificar el grado de cercanía genética entre las cepas de S. pyogenes.14, 20, 48 Además, permite observar los cambios en la región del genoma del EbHGA que codifica para los factores de mayor virulencia.47 Este método ofrece una alternativa para laboratorios sin equipos de secuenciación o de campos pulsados, ya que sólo requiere un equipo de PCR, una cámara horizontal, una microcentrífuga, un transiluminador de rayos UV y una cámara polaroid.

 

Electroforesis de multilocus de enzimas (MLEE). Esta técnica analiza diferentes locus de enzimas (polimorfismos genotípicos) que son utilizados como patrones de comparación de acuerdo con su movilidad electro-forética.6, 49 Esta técnica permite tipificar clonas de EbHGA con base en el análisis de la presencia y movilidad de 12 o más enzimas tales como alcohol deshidrogenasa (ADH), enolasa (ENOL), esterasa (EST), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPD-1), NADP fosforilada (GAPD-1), lactaglutationasa (GLO), glucosa 6-fosfato isomerasa (GPI), glutation reductasa (GRS), 3-hidroxibutirato deshidrogenasa (MPDH), maleato deshidrogenasa (MDH), manitol 1-fosfato deshidrogenasa (MPDH), nucleósido difosfato quinasa (NDPK), fosfoglicerato mutasa (SOD) y triosa fosfato- isomerasa (TPI). Aunque el grado de utilidad para tipificar las cepas de S. pyogenes es controversial, algunos estudios han encontrado un alto grado de correlación con los tipos M (con excepciones).26

 

Polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción fluorescentes (FAFLP).Es la amplificación de fragmentos fluorescentes de ADN a partir de la digestión enzimática (EcoRI y MseI) del ADN total de S. pyogenes usando una PCR con dioxinucleótidos trifosfatados (dNTPs) marcados con fluoresceína. Los productos amplificados se corren en un gel desnaturalizante de poliacrilamida, el cual es analizado mediante el software especializado GeneScan 2.1, que produce un electroferograma único para cada cepa logrando tipificar clonas de EbHGA. Es una técnica sensible, reproducible, rápida (2 a 2.5 horas) y fácil de desarrollar.45

 

 


 

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